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                產品簡介

                Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA(tRF&tiRNA)、snRNA和snoRNA等,是一類不具有蛋白編碼能力的RNA分子,能調控基因表達,在細胞生長、發育和代謝等基礎生物學過程中都扮演著重要的角色,甚至在癌癥等相關疾病形成過程中也起著關鍵的作用。高通量測序技術省去了煩瑣的Small RNA克隆文庫構建過程,可以一次性生成上百萬條Small RNA序列,能夠快速鑒定特定條件下表達的已知Small RNA并發現新的Small RNA,同時還可以研究不同條件下Small RNA的表達差異,并可以聯合轉錄組測序表達譜數據進行關聯分析。

                A workflow for Small RNA Sequencing

                Jai PM et al., RNA Mapping, 2014

                我們的優勢

                1. 針對動物(包括外泌體)Small RNA(miRNA、piRNA、tsRNA)提供定制化實驗分析方案;

                2. 不僅能高效準確發現并注釋非模式物種新的miRNA,還能進行piRNA、tiRNA、tRF等最新的研究;

                3. 及時更新miRBase、miRandaRNAhybrid等專業miRNA數據庫以及靶基因預測算法,保證分析結果緊跟行業前沿。

                樣本要求

                組織樣品:

                1. 動物組織:>200mg;

                2. 植物組織:>200mg;

                3. 細胞培養:>2x106個;

                4. 全血:>3ml;

                5. 菌體:>2x106個或>300mg。

                RNA樣品:

                1. 請提供體積15 μL - 100 μL,總量≥10μg,濃度≥ 200ng/μL的RNA;

                2. OD260/280介于1.8~2.2之間,OD260/230≥2.0,RIN≥6.5,28S:18S≥1.0,確保RNA無降解;

                3. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封;

                4. 樣品保存期間切忌反復凍融;

                5. 送樣時請使用干冰運輸。

                不同樣品之間存在差異,詳情請向烈冰咨詢

                實驗流程


                1. RNA提取及質控:RNA總量 > 1 μg ;RIN> 6.0

                2. RNA富集:切膠范圍10-50bp

                3. RNA質控:Agilent 2200質控

                4. 文庫構建:文庫分子18-30bp

                5. 上機測序:Small RNA測序NovaSeq、HiSeq、Ion Proton等測序儀都可以完成。測序數據量40M reads。

                數據分析流程

                >>動物小RNA






                >>植物小RNA


                結果示例

                1、數據過濾
                對于原始數據進行質量控制,排除序列中的過短序列,低質量序列,未測出序列,并去掉雙端接頭序列,以保證測序數據的質量與準確性,我們將從堿基質量,GC含量等角度對測序數據進行質量評估,過濾后的數據稱為Clean Data(過濾后數據)。

                堿基質量結果圖(過濾后)

                注:橫坐標表示堿基位點,縱坐標表示堿基質量值。



                2、序列比對和長度分析
                由于Small RNA中成員較多,且各成員有各自的長度區間,我們首先會將測序得到的數據比對到分析物種的miRNA數據庫中,再將unmapped reads比對到NCBI數據庫中,對比對到不同數據庫中的small RNA(miRNA、piRNA和tsRNA)序列進行長度分布統計,觀察各類small RNA的長度分布情況以及主峰所在的位置。

                small RNA長度分布情況

                注:左圖為miRNA長度分布圖;右圖為piRNA長度分布圖。



                3、堿基偏好性分析
                成熟的miRNA在首位往往就具有U的偏好性,同時來源于生殖細胞的piRNA,其首位也通常具有U偏好性。因此,在進行序列比對后,對于比對到不同數據庫中的small RNA序列進行長度分布統計,觀察各類small RNA的堿基偏好情況。

                small RNA堿基偏好性分析

                注:橫坐標表示序列長度,縱坐標表示百分比,不同顏色表示不同的核苷酸。


                4、表達量統計
                Small RNA測序最關鍵的步驟是對small RNA進行定量表達和差異篩選,將測序數據比對到各small RNA對應的數據庫后,采用表達量統計軟件對于每一個small RNA的Counts數進行標化。

                miRNAs表達量統計分析

                An X et al., Theriogenology, 2016

                注:該表格列舉了部分差異miRNAs的名稱和序列信息,NE(normalized expression)表示標化后的miRNA表達量。


                5、差異Small RNA篩選
                找到差異small RNA是整個研究的基礎,常用的差異篩選算法有DESeq、edgeR等,將表達量統計的結果進行差異篩選,計算實驗組 VS 對照組的差異情況,獲得差異倍數、顯著性(P-Value)以及誤判率(FDR),通過這些指標篩選出顯著性差異的Small RNA。

                差異miRNAs熱圖

                An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015

                注:橫軸表示組別,縱軸表示不同miRNAs。


                6、靶基因功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)
                采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據,對靶基因進行功能和信號通路分析,得到靶基因所顯著性富集的功能條目和Pathway條目,并繪制集靶基因、功能和pathway于一體的network。

                miRNA靶基因功能和pathway網絡圖

                An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015

                注:該圖表示miRNA-204靶向的基因,及其靶基因所顯著富集的GO條目(右)和Pathway條目(左)。


                高級數據分析
                1、Novel miRNA預測
                非模式物種中存在很多未被報道的Novel miRNA,將其找出并進行研究是一項重要內容,NovelBio團隊協助研究者將比對到基因組的reads提取出來,然后用行業內公認的算法,通過莖環結構自由能的計算,以及其他物種miRBase數據庫的比對,最后獲得預測的Novel miRNA。

                novel miRNAs的莖環結構

                An X et al, Theriogenology. 2016

                注:該圖展示了進一步分析與已知miRNA不匹配的測序reads預測的新的miRNA,這10個序列都具有顯著的莖-環發夾二級結構。



                2、Small RNA靶基因預測
                以差異的small RNA為研究對象,采用miranda算法與RNAHybrid算法進行靶基因預測,得到small RNA靶向到mRNA的3’UTR序列的靶基因結合位點,并繪制靶基因網絡圖。

                miRNAs靶基因網絡圖

                An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015

                注: 綠色表示下調的miRNAs,紅色表示上調的miRNAs。


                3、Small RNA趨勢分析
                以各分組間的miRNA的TPM.txt文件為研究對象,采用STEM算法,進行趨勢分析,得到按照樣本邏輯順序所在趨勢

                DCs分化過程中miRNAs表達情況

                Su XP et al., Nature Communications, 2013

                注:該圖展示了DCs分化過程中miRNAs表達情況。H、I、M和R分別代表分化的四個階段:H—HSCs;I—imDCs;M—maDCs;R—DCreg,左上角的數字代表將391miRNAs分成了26clusters,左下角的數字代表每個cluster中miRNAs的數量,有顏色的clusters代表miRNAs顯著富集。


                文獻示例

                [1] Zheng L, Zhang X, Zhang H, et al. The miR164-dependent regulatory pathway in developing maize seed. Mol Genet Genomics. 2019 Jan 3. (IF=2.734)


                [2] Xu C, Zhang H, Zhou W, et al. MicroRNA-10a, -210, and -563 as circulating biomarkers for ossification of the posterior longitudinal ligament. Spine J. 2018 Oct 20. pii: S1529-9430(18)31165-3. (IF=3.119)


                [3] Wang Y, Zhang CY, Xia RH, et al. The MYB/miR-130a/NDRG2 axis modulates tumor proliferation and metastatic potential in salivary adenoid cystic carcinoma. Cell Death Dis. 2018 Sep 11;9(9):917. (IF=5.638)


                [4] Chen X, Hao Z, Wei G, et al. The microRNA-10a/ID3/RUNX2 axis modulates the development of Ossification of Posterior Longitudinal Ligament. Sci Rep. 2018 Jun 15;8(1):9225. (IF=4.122)


                [5] He Q, et al. Downregulation of miR-7116-5p in microglia by MPP1 sensitizes TNF-a production to induce dopaminergic neuron damage. Glia. 2017 Aug;65(8):1251-1263. (IF=6.2)


                [6] Xu C, et al. Integrated microRNA-mRNA analyses reveal OPLL specific microRNA regulatory network using high-throughput sequencing. Sci Rep. 2016 Feb 12;6:21580. (IF=5.578)


                [7] Liu R, et al. DNMT1-microRNA126 epigenetic circuit contributes to esophageal squamous cell carcinoma growth via ADAM9-EGFR-AKT signaling. Clin Cancer Res. 2015 Feb 15;21(4):854-63. (IF=8.193)


                [8] Cheng T, et al. MeCP2 Suppresses Nuclear MicroRNA Processing and Dendritic Growth by Regulating the DGCR8/Drosha Complex. Dev Cell. 2014 Mar 10;28(5):547-60. (IF=14.08)


                [9] Su X, et al. miRNomes of haematopoietic stem cells and dendritic cells identify miR-30b as a regulator of Notch1. Nat Commun. 2013;4:2903. (IF=10.02)


                [10] Xu C, et al. miRNA -100 Inhibits Human Bladder Urothelial Carcinogenesis by Directly Targeting mTOR. Molecular Cancer Therapeutics. 2013, Feb 12:207-219. (IF=5.599)


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